Prinsip Dasar Preparasi Kromosom

Penulis
Afiliasi

Mohammad Rizki

FKIK Universitas Mataram

Diterbitkan

22 Juli 2026

Posisi Materi dalam Workshop

  1. Struktur dan Klasifikasi Kromosom
  2. Pengantar Sitogenetika dan Analisis Kariotipe
  3. Prinsip Dasar Preparasi Kromosom ← materi sesi ini
  4. Teknik Analisis dan Penyusunan Kariotipe
Catatan

Materi ini berfokus pada proses laboratorium mengubah spesimen biologis (darah, sumsum tulang, jaringan) menjadi sediaan kromosom siap analisis — termasuk protokol teknis tiap tahap — bukan pada interpretasi hasil, yang akan dibahas pada materi berikutnya.

Tujuan Pembelajaran

Setelah mengikuti sesi ini, peserta diharapkan mampu:

  • Menjelaskan alur kerja preparasi kromosom dari penerimaan spesimen hingga sediaan siap analisis
  • Menjelaskan prinsip dan tujuan tiap tahap: kultur sel, arrest mitosis, hipotonik, fiksasi, dropping, aging, dan banding/pewarnaan
  • Menerapkan protokol teknis (volume, konsentrasi, suhu, dan durasi) pada setiap tahap preparasi
  • Mengidentifikasi faktor teknis yang memengaruhi kualitas sebaran metafase
  • Melakukan verifikasi kesiapan sediaan sebelum diserahkan untuk penyusunan karyogram

Alur Kerja Preparasi Kromosom

flowchart LR
  A[Penerimaan Spesimen] --> B[Kultur Sel]
  B --> C["Arrest Mitosis (Colcemid)"]
  C --> D[Hipotonik]
  D --> E[Fiksasi]
  E --> F["Dropping & Slide Preparation"]
  F --> G["Aging Sediaan"]
  G --> H["Banding & Pewarnaan"]
  H --> I["QC Sediaan"]
  I -.-> J["Penyusunan Karyogram →"]
  style J stroke-dasharray: 5 5

Tekankan bahwa setiap tahap saling bergantung — kesalahan di satu tahap terbawa ke tahap berikutnya. Kotak terakhir (garis putus-putus) adalah materi 4, hanya ditampilkan sebagai penanda alur.

1. Penerimaan dan Penanganan Spesimen

Jenis Spesimen Indikasi Umum Wadah/Antikoagulan
Darah tepi (limfosit) Kariotipe konstitusional Heparin (Na/Li-heparin), bukan EDTA
Sumsum tulang Keganasan hematologi Heparin, kultur segera
Cairan amnion / vili korialis Diagnosis prenatal Media transport steril
Jaringan (mis. produk konsepsi) Kegagalan kehamilan berulang Media transport, suhu ruang
Catatan

Sampel harus segera dikirim ke laboratorium (idealnya < 24–48 jam), dijaga suhu ruang, tidak dibekukan — sel harus tetap hidup untuk dikultur.

2. Kultur Sel — Prinsip

  • Limfosit T distimulasi agar masuk siklus sel menggunakan mitogen (paling umum: Phytohaemagglutinin/PHA)
  • Media kultur lengkap: RPMI-1640 + serum + antibiotik, diinkubasi 37 °C, 5% CO₂
  • Lama kultur standar darah tepi: ± 72 jam
  • Sumsum tulang: kultur langsung (direct harvest, tanpa stimulasi) dan/atau kultur short-term 24–48 jam
  • Tujuan: memperbanyak sel yang sedang aktif membelah sebagai sumber kromosom metafase

2a. Protokol Ringkas — Kultur Darah Tepi

  1. Inokulasi 0,3–0,5 mL darah heparin ke dalam 5 mL media kultur lengkap (RPMI-1640 + FBS 15–20% + PHA + antibiotik) dalam tabung/flask steril
  2. Homogenkan perlahan, tutup rapat (atau kendorkan tutup bila memakai flask berventilasi CO₂)
  3. Inkubasi 37 °C, 5% CO₂, selama 68–72 jam
  4. Periksa kekeruhan media pada hari ke-2–3 sebagai indikator pertumbuhan sel (opsional, sesuai SOP)
  5. Pada ± 1–2 jam sebelum panen, lanjutkan ke tahap arrest mitosis
Catatan

Volume dan rasio dapat bervariasi antar-SOP laboratorium — sesuaikan dengan protokol validasi institusi masing-masing.

3. Arrest Mitosis (Colcemid) — Prinsip

  • Colcemid (analog kolkisin) ditambahkan pada akhir masa kultur
  • Menghambat pembentukan benang spindel (mikrotubulus) sehingga sel berhenti pada fase metafase
  • Metafase dipilih karena kromosom paling terkondensasi dan mudah dianalisis
  • Konsentrasi dan durasi paparan harus tepat — terlalu lama menyebabkan kontraksi kromosom berlebihan

Kata kunci

  • Target: metafase
  • Mekanisme: hambat spindel
  • Durasi: menit hingga ~1 jam

3a. Protokol Ringkas — Colcemid

  1. Tambahkan larutan colcemid (stok umum 10 µg/mL) ke kultur hingga konsentrasi akhir ± 0,05–0,1 µg/mL
  2. Homogenkan, kembalikan ke inkubator 37 °C
  3. Paparan 20–30 menit untuk darah tepi (protokol sumsum tulang sering lebih singkat, ± 15–20 menit, karena indeks mitosis basal lebih tinggi)
  4. Setelah waktu paparan tercapai, segera lanjutkan ke tahap panen (harvest) — pindahkan suspensi sel ke tabung sentrifus
  5. Sentrifugasi ± 1000–1200 rpm, 8–10 menit, buang supernatan, sisakan pelet sel

4. Larutan Hipotonik — Prinsip

  • Sel dipaparkan larutan hipotonik (umumnya KCl 0,075 M)
  • Sel menyerap air → membengkak → kromosom menyebar dan terpisah satu sama lain
  • Langkah kritis yang menentukan kualitas sebaran metafase pada sediaan akhir
  • Undertreatment menyulitkan sebaran; overtreatment menyebabkan sel pecah/hilang

4a. Protokol Ringkas — Hipotonik

  1. Resuspensi pelet sel secara perlahan (ketuk-ketuk dasar tabung) hingga tidak ada gumpalan
  2. Tambahkan KCl 0,075 M hangat (37 °C) tetes demi tetes sambil terus dihomogenkan, hingga volume ± 8–10 mL
  3. Inkubasi 37 °C selama 15–25 menit (waktu disesuaikan jenis spesimen dan validasi lab)
  4. Hentikan reaksi dengan menambahkan 2–3 tetes fiksatif awal (Carnoy 3:1) sebelum sentrifugasi — mencegah lisis berlebihan
  5. Sentrifugasi 1000–1200 rpm, 8–10 menit, buang supernatan

5. Fiksasi — Prinsip

  • Fiksatif standar: Carnoy’s fixative — metanol : asam asetat glasial rasio 3:1
  • Fungsi: menghentikan reaksi hipotonik, mengeraskan membran sel, mempertahankan morfologi kromosom
  • Dilakukan bertahap (2–3 kali penggantian fiksatif) hingga pelet sel jernih/bebas debris
  • Sediaan hasil fiksasi disimpan dingin bila belum langsung diproses
Penting

Fiksatif harus dibuat segar (idealnya digunakan dalam beberapa jam) — fiksatif lama/lembap menurunkan kualitas sebaran.

5a. Protokol Ringkas — Fiksasi

  1. Tambahkan fiksatif Carnoy dingin tetes demi tetes sambil vortex/homogenisasi lembut hingga volume ± 8–10 mL (mencegah gumpalan sel)
  2. Diamkan 20–30 menit pada suhu 4 °C (lemari es) atau suhu ruang sesuai SOP
  3. Sentrifugasi 1000–1200 rpm, 8–10 menit, buang supernatan
  4. Ulangi siklus fiksasi 2–3 kali hingga pelet sel tampak putih bersih dan supernatan jernih (bebas warna kemerahan sisa eritrosit)
  5. Pada siklus terakhir, sesuaikan volume akhir suspensi (kekentalan) sesuai kepadatan sel yang diinginkan untuk dropping

6. Dropping & Pembuatan Sediaan — Prinsip

  • Suspensi sel-fiksatif diteteskan (dropped) dari ketinggian tertentu ke kaca objek yang dingin dan lembap
  • Energi benturan tetesan membantu membran sel pecah sehingga kromosom menyebar rata dalam satu bidang
  • Faktor yang memengaruhi hasil: kelembapan ruangan, suhu kaca objek, tinggi jatuh tetesan, sudut kemiringan slide

6a. Protokol Ringkas — Dropping

  1. Siapkan kaca objek bersih (dicuci etanol/akuades), simpan dingin dan lembap (mis. di atas es atau dalam kondisi humid ± 45–55% RH)
  2. Teteskan 2–3 tetes suspensi sel dari ketinggian ± 20–30 cm ke permukaan slide yang sedikit dimiringkan
  3. Segera hembuskan napas ringan atau lewatkan di atas uap air panas (steam) untuk membantu penyebaran kromosom (opsional, sesuai SOP)
  4. Keringkan slide di suhu ruang atau di atas hot plate (37–40 °C) hingga tidak lembap
  5. Periksa sekilas dengan mikroskop kontras fase — pastikan tampak sebaran metafase sebelum melanjutkan

7. Aging (Pematangan) Sediaan

  • Sediaan yang baru dibuat umumnya belum optimal untuk banding — kromosom perlu proses “pematangan”
  • Metode umum:
    • Aging alami: disimpan suhu ruang 1–7 hari
    • Aging dipercepat: oven 60 °C selama 1–2 jam, atau 37 °C semalam
  • Tujuan: memperbaiki hasil pola pita saat tripsinisasi (pita lebih jelas dan konsisten)
  • Slide yang terlalu “muda” (baru dibuat) sering menghasilkan pita kabur; terlalu “tua” dapat over-tripsinisasi

8. Banding & Pewarnaan Kromosom — Prinsip

G-banding (GTG-banding) — paling umum

  • Perlakuan tripsin ringan + pewarnaan Giemsa
  • Menghasilkan pola pita gelap-terang khas tiap kromosom
  • Standar internasional untuk kariotipe rutin

Teknik lain (sekilas)

  • Q-banding: quinacrine, fluoresensi
  • R-banding: pola pita kebalikan G-banding
  • C-banding: heterokromatin sentromer
  • FISH: pelengkap molekuler, bukan pengganti kariotipe konvensional

8a. Protokol Ringkas — GTG-Banding

  1. Celupkan slide ke larutan tripsin encer (mis. tripsin 0,025–0,05% dalam larutan salin) selama 5–20 detik (waktu titrasi tiap batch tripsin & usia slide)
  2. Bilas segera pada larutan salin buffer (PBS) untuk menghentikan aktivitas tripsin
  3. Bilas kembali pada akuades atau buffer, lalu keringkan sekilas
  4. Warnai dengan larutan Giemsa (± 5–10% dalam buffer Gurr/phosphate buffer pH 6,8) selama 8–12 menit
  5. Bilas dengan air mengalir lembut, keringkan pada suhu ruang atau hot plate rendah
  6. Periksa hasil pita di bawah mikroskop — pola pita gelap-terang harus jelas dan tidak kabur sebelum lanjut ke pemindaian
Penting

Waktu tripsinisasi adalah parameter paling sensitif — selalu lakukan slide uji (test slide) untuk titrasi sebelum memproses seluruh batch.

Checklist Kesiapan Sediaan untuk Penyusunan Karyogram

Catatan

Sediaan yang memenuhi kriteria di atas siap diserahkan ke tahap pemindaian, capture, dan penyusunan karyogram — dibahas mendalam pada materi berikutnya.

Sumber Kesalahan Umum dalam Preparasi

Tahap Masalah Umum Dampak
Kultur Waktu inkubasi tidak tepat, kontaminasi Indeks mitosis rendah
Colcemid Konsentrasi/waktu tidak sesuai Kromosom terlalu pendek/panjang
Hipotonik Waktu terlalu singkat/lama Sebaran buruk atau sel pecah
Fiksasi Rasio/kesegaran fiksatif tidak tepat Kromosom kabur/menggumpal
Dropping Kelembapan/suhu tidak sesuai Kromosom menumpuk atau terlalu menyebar
Aging Terlalu muda/tua Pita kabur atau over-tripsinisasi
Banding Waktu tripsinisasi tidak tepat Pita terlalu gelap/pudar

Kendali Mutu Tahap Preparasi

  • Verifikasi identitas spesimen sejak penerimaan (kesesuaian label, formulir, waktu pengiriman)
  • Kontrol kultur: viabilitas sel dan indeks mitosis yang cukup
  • Kontrol sediaan: sebaran metafase memadai, minim tumpang tindih
  • Kontrol banding: kualitas pita jelas dan konsisten
  • Dokumentasi tiap tahap (waktu, reagen, lot/batch) untuk telusur mutu (traceability)

Ringkasan

  1. Preparasi kromosom adalah rangkaian proses laboratorium yang mengubah spesimen biologis menjadi sediaan siap analisis
  2. Alur: spesimen → kultur → arrest mitosis → hipotonik → fiksasi → dropping → aging → banding → QC
  3. Setiap tahap memiliki parameter teknis spesifik (volume, konsentrasi, suhu, durasi) yang harus dikendalikan
  4. Verifikasi kesiapan sediaan (checklist) sebelum diserahkan ke tahap analisis
  5. Sediaan yang telah lolos QC selanjutnya masuk ke materi “Teknik Analisis dan Penyusunan Kariotipe”

Terima kasih

Selanjutnya: Teknik Analisis dan Penyusunan Kariotipe — cara membaca sediaan, menyusun karyogram, dan menginterpretasikan hasil.

Referensi

  • McGowan-Jordan J, Hastings RJ, Moore S, editors. ISCN 2020: An International System for Human Cytogenomic Nomenclature. Karger, 2020.
  • Gersen SL, Keagle MB, editors. The Principles of Clinical Cytogenetics. Springer.
  • Nussbaum RL, McInnes RR, Willard HF. Thompson & Thompson Genetics in Medicine. Elsevier.
  • Barch MJ, Knutsen T, Spurbeck JL, editors. The AGT Cytogenetics Laboratory Manual. 4th ed. Wiley-Blackwell.