Prinsip Dasar Preparasi Kromosom

Mohammad Rizki

mohammadrizki@unram.ac.id

FKIK Universitas Mataram

2026-07-22

Posisi Materi dalam Workshop

Struktur dan Klasifikasi Kromosom
Pengantar Sitogenetika dan Analisis Kariotipe
Prinsip Dasar Preparasi Kromosom ← materi sesi ini
Teknik Analisis dan Penyusunan Kariotipe

Catatan

Materi ini berfokus pada proses laboratorium mengubah spesimen biologis (darah, sumsum tulang, jaringan) menjadi sediaan kromosom siap analisis — termasuk protokol teknis tiap tahap — bukan pada interpretasi hasil, yang akan dibahas pada materi berikutnya.

Tujuan Pembelajaran

Setelah mengikuti sesi ini, peserta diharapkan mampu:

Menjelaskan alur kerja preparasi kromosom dari penerimaan spesimen hingga sediaan siap analisis
Menjelaskan prinsip dan tujuan tiap tahap: kultur sel, arrest mitosis, hipotonik, fiksasi, dropping, aging, dan banding/pewarnaan
Menerapkan protokol teknis (volume, konsentrasi, suhu, dan durasi) pada setiap tahap preparasi
Mengidentifikasi faktor teknis yang memengaruhi kualitas sebaran metafase
Melakukan verifikasi kesiapan sediaan sebelum diserahkan untuk penyusunan karyogram

Alur Kerja Preparasi Kromosom

flowchart LR
  A[Penerimaan Spesimen] --> B[Kultur Sel]
  B --> C["Arrest Mitosis (Colcemid)"]
  C --> D[Hipotonik]
  D --> E[Fiksasi]
  E --> F["Dropping & Slide Preparation"]
  F --> G["Aging Sediaan"]
  G --> H["Banding & Pewarnaan"]
  H --> I["QC Sediaan"]
  I -.-> J["Penyusunan Karyogram →"]
  style J stroke-dasharray: 5 5

1. Penerimaan dan Penanganan Spesimen

Jenis Spesimen	Indikasi Umum	Wadah/Antikoagulan
Darah tepi (limfosit)	Kariotipe konstitusional	Heparin (Na/Li-heparin), bukan EDTA
Sumsum tulang	Keganasan hematologi	Heparin, kultur segera
Cairan amnion / vili korialis	Diagnosis prenatal	Media transport steril
Jaringan (mis. produk konsepsi)	Kegagalan kehamilan berulang	Media transport, suhu ruang

Catatan

Sampel harus segera dikirim ke laboratorium (idealnya < 24–48 jam), dijaga suhu ruang, tidak dibekukan — sel harus tetap hidup untuk dikultur.

2. Kultur Sel — Prinsip

Limfosit T distimulasi agar masuk siklus sel menggunakan mitogen (paling umum: Phytohaemagglutinin/PHA)
Media kultur lengkap: RPMI-1640 + serum + antibiotik, diinkubasi 37 °C, 5% CO₂
Lama kultur standar darah tepi: ± 72 jam
Sumsum tulang: kultur langsung (direct harvest, tanpa stimulasi) dan/atau kultur short-term 24–48 jam
Tujuan: memperbanyak sel yang sedang aktif membelah sebagai sumber kromosom metafase

2a. Protokol Ringkas — Kultur Darah Tepi

Inokulasi 0,3–0,5 mL darah heparin ke dalam 5 mL media kultur lengkap (RPMI-1640 + FBS 15–20% + PHA + antibiotik) dalam tabung/flask steril
Homogenkan perlahan, tutup rapat (atau kendorkan tutup bila memakai flask berventilasi CO₂)
Inkubasi 37 °C, 5% CO₂, selama 68–72 jam
Periksa kekeruhan media pada hari ke-2–3 sebagai indikator pertumbuhan sel (opsional, sesuai SOP)
Pada ± 1–2 jam sebelum panen, lanjutkan ke tahap arrest mitosis

Catatan

Volume dan rasio dapat bervariasi antar-SOP laboratorium — sesuaikan dengan protokol validasi institusi masing-masing.

3. Arrest Mitosis (Colcemid) — Prinsip

Colcemid (analog kolkisin) ditambahkan pada akhir masa kultur
Menghambat pembentukan benang spindel (mikrotubulus) sehingga sel berhenti pada fase metafase
Metafase dipilih karena kromosom paling terkondensasi dan mudah dianalisis
Konsentrasi dan durasi paparan harus tepat — terlalu lama menyebabkan kontraksi kromosom berlebihan

Kata kunci

Target: metafase
Mekanisme: hambat spindel
Durasi: menit hingga ~1 jam

3a. Protokol Ringkas — Colcemid

Tambahkan larutan colcemid (stok umum 10 µg/mL) ke kultur hingga konsentrasi akhir ± 0,05–0,1 µg/mL
Homogenkan, kembalikan ke inkubator 37 °C
Paparan 20–30 menit untuk darah tepi (protokol sumsum tulang sering lebih singkat, ± 15–20 menit, karena indeks mitosis basal lebih tinggi)
Setelah waktu paparan tercapai, segera lanjutkan ke tahap panen (harvest) — pindahkan suspensi sel ke tabung sentrifus
Sentrifugasi ± 1000–1200 rpm, 8–10 menit, buang supernatan, sisakan pelet sel

4. Larutan Hipotonik — Prinsip

Sel dipaparkan larutan hipotonik (umumnya KCl 0,075 M)
Sel menyerap air → membengkak → kromosom menyebar dan terpisah satu sama lain
Langkah kritis yang menentukan kualitas sebaran metafase pada sediaan akhir
Undertreatment menyulitkan sebaran; overtreatment menyebabkan sel pecah/hilang

4a. Protokol Ringkas — Hipotonik

Resuspensi pelet sel secara perlahan (ketuk-ketuk dasar tabung) hingga tidak ada gumpalan
Tambahkan KCl 0,075 M hangat (37 °C) tetes demi tetes sambil terus dihomogenkan, hingga volume ± 8–10 mL
Inkubasi 37 °C selama 15–25 menit (waktu disesuaikan jenis spesimen dan validasi lab)
Hentikan reaksi dengan menambahkan 2–3 tetes fiksatif awal (Carnoy 3:1) sebelum sentrifugasi — mencegah lisis berlebihan
Sentrifugasi 1000–1200 rpm, 8–10 menit, buang supernatan

5. Fiksasi — Prinsip

Fiksatif standar: Carnoy’s fixative — metanol : asam asetat glasial rasio 3:1
Fungsi: menghentikan reaksi hipotonik, mengeraskan membran sel, mempertahankan morfologi kromosom
Dilakukan bertahap (2–3 kali penggantian fiksatif) hingga pelet sel jernih/bebas debris
Sediaan hasil fiksasi disimpan dingin bila belum langsung diproses

Penting

Fiksatif harus dibuat segar (idealnya digunakan dalam beberapa jam) — fiksatif lama/lembap menurunkan kualitas sebaran.

5a. Protokol Ringkas — Fiksasi

Tambahkan fiksatif Carnoy dingin tetes demi tetes sambil vortex/homogenisasi lembut hingga volume ± 8–10 mL (mencegah gumpalan sel)
Diamkan 20–30 menit pada suhu 4 °C (lemari es) atau suhu ruang sesuai SOP
Sentrifugasi 1000–1200 rpm, 8–10 menit, buang supernatan
Ulangi siklus fiksasi 2–3 kali hingga pelet sel tampak putih bersih dan supernatan jernih (bebas warna kemerahan sisa eritrosit)
Pada siklus terakhir, sesuaikan volume akhir suspensi (kekentalan) sesuai kepadatan sel yang diinginkan untuk dropping

6. Dropping & Pembuatan Sediaan — Prinsip

Suspensi sel-fiksatif diteteskan (dropped) dari ketinggian tertentu ke kaca objek yang dingin dan lembap
Energi benturan tetesan membantu membran sel pecah sehingga kromosom menyebar rata dalam satu bidang
Faktor yang memengaruhi hasil: kelembapan ruangan, suhu kaca objek, tinggi jatuh tetesan, sudut kemiringan slide

6a. Protokol Ringkas — Dropping

Siapkan kaca objek bersih (dicuci etanol/akuades), simpan dingin dan lembap (mis. di atas es atau dalam kondisi humid ± 45–55% RH)
Teteskan 2–3 tetes suspensi sel dari ketinggian ± 20–30 cm ke permukaan slide yang sedikit dimiringkan
Segera hembuskan napas ringan atau lewatkan di atas uap air panas (steam) untuk membantu penyebaran kromosom (opsional, sesuai SOP)
Keringkan slide di suhu ruang atau di atas hot plate (37–40 °C) hingga tidak lembap
Periksa sekilas dengan mikroskop kontras fase — pastikan tampak sebaran metafase sebelum melanjutkan

7. Aging (Pematangan) Sediaan

Sediaan yang baru dibuat umumnya belum optimal untuk banding — kromosom perlu proses “pematangan”
Metode umum:
- Aging alami: disimpan suhu ruang 1–7 hari
- Aging dipercepat: oven 60 °C selama 1–2 jam, atau 37 °C semalam
Tujuan: memperbaiki hasil pola pita saat tripsinisasi (pita lebih jelas dan konsisten)
Slide yang terlalu “muda” (baru dibuat) sering menghasilkan pita kabur; terlalu “tua” dapat over-tripsinisasi

8. Banding & Pewarnaan Kromosom — Prinsip

G-banding (GTG-banding) — paling umum

Perlakuan tripsin ringan + pewarnaan Giemsa
Menghasilkan pola pita gelap-terang khas tiap kromosom
Standar internasional untuk kariotipe rutin

Teknik lain (sekilas)

Q-banding: quinacrine, fluoresensi
R-banding: pola pita kebalikan G-banding
C-banding: heterokromatin sentromer
FISH: pelengkap molekuler, bukan pengganti kariotipe konvensional

8a. Protokol Ringkas — GTG-Banding

Celupkan slide ke larutan tripsin encer (mis. tripsin 0,025–0,05% dalam larutan salin) selama 5–20 detik (waktu titrasi tiap batch tripsin & usia slide)
Bilas segera pada larutan salin buffer (PBS) untuk menghentikan aktivitas tripsin
Bilas kembali pada akuades atau buffer, lalu keringkan sekilas
Warnai dengan larutan Giemsa (± 5–10% dalam buffer Gurr/phosphate buffer pH 6,8) selama 8–12 menit
Bilas dengan air mengalir lembut, keringkan pada suhu ruang atau hot plate rendah
Periksa hasil pita di bawah mikroskop — pola pita gelap-terang harus jelas dan tidak kabur sebelum lanjut ke pemindaian

Penting

Waktu tripsinisasi adalah parameter paling sensitif — selalu lakukan slide uji (test slide) untuk titrasi sebelum memproses seluruh batch.

Checklist Kesiapan Sediaan untuk Penyusunan Karyogram

Jumlah metafase pada slide memadai (idealnya banyak lapangan pandang dengan metafase berkualitas)
Sebaran kromosom tidak tumpang tindih, kontraksi cukup (tidak terlalu memanjang/memendek)
Pola pita G-banding jelas, kontras gelap-terang konsisten antar-metafase
Latar belakang slide bersih dari debris sitoplasma/sisa sel
Identitas/label sediaan sudah terverifikasi sesuai spesimen asal

Catatan

Sediaan yang memenuhi kriteria di atas siap diserahkan ke tahap pemindaian, capture, dan penyusunan karyogram — dibahas mendalam pada materi berikutnya.

Sumber Kesalahan Umum dalam Preparasi

Tahap	Masalah Umum	Dampak
Kultur	Waktu inkubasi tidak tepat, kontaminasi	Indeks mitosis rendah
Colcemid	Konsentrasi/waktu tidak sesuai	Kromosom terlalu pendek/panjang
Hipotonik	Waktu terlalu singkat/lama	Sebaran buruk atau sel pecah
Fiksasi	Rasio/kesegaran fiksatif tidak tepat	Kromosom kabur/menggumpal
Dropping	Kelembapan/suhu tidak sesuai	Kromosom menumpuk atau terlalu menyebar
Aging	Terlalu muda/tua	Pita kabur atau over-tripsinisasi
Banding	Waktu tripsinisasi tidak tepat	Pita terlalu gelap/pudar

Kendali Mutu Tahap Preparasi

Verifikasi identitas spesimen sejak penerimaan (kesesuaian label, formulir, waktu pengiriman)
Kontrol kultur: viabilitas sel dan indeks mitosis yang cukup
Kontrol sediaan: sebaran metafase memadai, minim tumpang tindih
Kontrol banding: kualitas pita jelas dan konsisten
Dokumentasi tiap tahap (waktu, reagen, lot/batch) untuk telusur mutu (traceability)

Ringkasan

Preparasi kromosom adalah rangkaian proses laboratorium yang mengubah spesimen biologis menjadi sediaan siap analisis
Alur: spesimen → kultur → arrest mitosis → hipotonik → fiksasi → dropping → aging → banding → QC
Setiap tahap memiliki parameter teknis spesifik (volume, konsentrasi, suhu, durasi) yang harus dikendalikan
Verifikasi kesiapan sediaan (checklist) sebelum diserahkan ke tahap analisis
Sediaan yang telah lolos QC selanjutnya masuk ke materi “Teknik Analisis dan Penyusunan Kariotipe”

Terima kasih

Selanjutnya: Teknik Analisis dan Penyusunan Kariotipe — cara membaca sediaan, menyusun karyogram, dan menginterpretasikan hasil.

Referensi

McGowan-Jordan J, Hastings RJ, Moore S, editors. ISCN 2020: An International System for Human Cytogenomic Nomenclature. Karger, 2020.
Gersen SL, Keagle MB, editors. The Principles of Clinical Cytogenetics. Springer.
Nussbaum RL, McInnes RR, Willard HF. Thompson & Thompson Genetics in Medicine. Elsevier.
Barch MJ, Knutsen T, Spurbeck JL, editors. The AGT Cytogenetics Laboratory Manual. 4th ed. Wiley-Blackwell.